1. 試劑
·從lacY recombinant大腸桿菌T206制備的膜泡
·n-Octyl-β-D-glucoside
·膽酸鈉 （Sodium cholate）
·Dithiothreitol （DTT）
·取自大腸桿菌的磷脂 （Avanti Biochem.公司）
·DEAE-Sepharose CL-6B （GE Healthcare公司）
·磷酸鉀 （Potassium Phosphate）
·乳糖 （lactose）
·尿素 （生化級(jí)）
·磷酸
2. 方法
以下操作，在沒(méi)有特指時(shí)的溫度是指4℃，用Vortex mixer攪拌。
1） 要得到約10 mg的蛋白質(zhì)，可以取外翻型膜泡 （inside-out vesicles） 12.5 mg，加入1 ml緩沖液 （50 mmol/l 磷酸鉀，pH7.5、0.5 mmol/l DTT，10 mmol/l乳糖）制成懸濁液。
2） 在室溫條件下，邊攪拌，邊滴加等量的尿素溶液（10 mmol/l）。
3） 在冰浴中放置10分鐘后，在175,000× 的速度條件下離心1小時(shí)。
4） 沉淀用1.75 ml緩沖液 （50 mmol/l磷酸鉀，pH7.5） 制成懸濁液。邊攪拌，邊加入膽酸鈉溶液 （20%w/v，pH7.8），終濃度為6%。
5） 在冰浴中放置20分鐘后，在26,000×g的速度條件下離心15分鐘。
* 以上操作是為了去除膜中不需要的蛋白質(zhì)。
6） 沉淀用5 ml緩沖液 （10 mmol/l磷酸鉀，pH5.8） 制成懸濁液，離心，重復(fù)此步驟1-2次。
7） 沉淀用1.45 ml緩沖液 （10 mmol/磷酸鉀，pH5.8） 制成懸濁液，加入
8） 在上述溶液中加入146 µl n-Octyl-β-D-glucoside （15% w/v，10 mmol/l磷酸鉀，pH5.8），使終濃度為1.25%，
蛋白質(zhì)/磷脂/去垢劑的比例約為1:3:10。
9） 攪拌時(shí)請(qǐng)注意不要起泡沫，在冰浴中放置10分鐘后攪拌，然后在175,000× 的速度下離心1小時(shí)。
10） 取上清，用磷酸溶液 （10 mmol/l 磷酸, 含1.25% n-Octyl-β-D-glucoside） 調(diào)節(jié)pH至5.8。
11） 用DEAE-Sepharose 純化柱純化1 ml蛋白質(zhì)提取液 （含約300 µg 蛋白質(zhì)）。
溶出液：10 mmol/l 磷酸鉀，pH5.8，1 mmol/l DTT，20 mmol/l乳糖, 0.25 mg 磷脂/ml, 1.25%（w/v） n-Octyl-β-D-glucoside
II. 用 n-Heptyl-β-D-thioglucoside提取腸炎弧菌的膜結(jié)合性 5'-核苷酸酶
1. 試劑
·采用French Pressure法制備的膜泡
·n-Heptyl-β-D-thioglucoside
·EDTA-2K
·Dithiothreitol （DTT）
·Tricine
·MOPS
·Tris
·氯化鈉
·硫酸鎂
·2-Mercaptoethanol
·DEAE-Sepharose CL-6B （GE Healthcare公司）
2. 方法
以下操作，在沒(méi)有特指時(shí)的溫度是指4℃。
1） 取腸炎弧菌的的膜泡 （含145 mg蛋白質(zhì)） 用30 ml緩沖液（3 mmol/l Tricine-Tris、pH8.0、0.5 mmol/l EDTA-2K、1 mmol/l 2-Mercaptoethanol） 制成懸濁液。在冰浴中輕輕地?cái)嚢杓s30分鐘后，105,000×g離心1小時(shí)。
2） 加入含有n-Heptyl-β-D-thioglucoside 40 mmol/l的緩沖液（20 mmol/l MOPS-Tris、pH7.5、5 mmol/l硫酸鎂、1 mmol/l DTT） 制成懸濁液，蛋白質(zhì)濃度約為1 mg/ml。在冰浴中輕輕地?fù)u勻約15分鐘。
3） 105,000×g離心1小時(shí)，得到5'-核苷酸酶的上清。
4） 用DEAE-Sepharose 純化柱純化上清。溶出液：50 mmol/l MOPS-Tris、pH 8.0、5 mmol/l硫酸鎂、1 mmol/l DTT、40 mmol/l n-Heptyl-β-D-thioglucoside、100→400 mmol/l （梯度）氯化鈉
III. 用CHAPS提取巨噬細(xì)胞的細(xì)胞骨架
1．試劑
·S.typhimurium LPS （Difco公司）
·胎牛血清 （FBS）
·肝素 （heparin）
·Dulbecco's MEM （DMEM）
·Plasticcoverslip （SUMITOMO BAKELITE 公司、celldesk）
·PIPES
·HEPES
·GEDTA
·Phorbol 12-myristate 13-acetate （PMA、Sigma公司）
·氯化鎂
·CHAPS （在硅膠干燥器中干燥約2周后使用）
2. 方法
1） 用滅菌蒸餾水將 S.typhimurium LPS配制成200 µg/ml。給小鼠 （SLC-ICR、7-10周齡） 腹腔注射，劑量為0.25 ml/只。
2） 5-6天后，用10 mmol/l HEPES（添加10% FBS、10 U/ml肝素、含DMEM pH7.1）洗凈腹腔，收集細(xì)胞。
3） 用
4） 用含有10% FBS的DMEM調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至10e6個(gè)/ml，移至培養(yǎng)皿中。
5） 在
6） 將蓋玻片一張一張放入
7） 在含有10% FBS的DMEM中加入稀釋的PMA，在CO2培養(yǎng)箱中
8） 用室溫DMEM將貼付著細(xì)胞的蓋玻片洗凈10分鐘。
9） 用室溫的PHEM 緩沖液 （60 mmol/l PIPES、25 mmol/l HEPES、10 mmol/l GEDTA、2 mmol/l氯化鎂、pH6.9）
清洗2次 （10分鐘/次）。
10） 預(yù)先將蓋玻片放置在
11） 用PHEM緩沖液配制0.5%CHAPS溶液*2,*3，取15 ml加入*4直徑為
將貼付著細(xì)胞的蓋玻片放在如上的培養(yǎng)皿中（2張蓋玻片/1個(gè)培養(yǎng)皿），放置3分鐘后會(huì)露出細(xì)胞骨架，這時(shí)輕輕振搖培養(yǎng)皿45-60秒。
12） 用
*1 清洗不足的話，會(huì)降低細(xì)胞骨架露出率。
*2 CHAPS溶液要在使用前1小時(shí)內(nèi)配制，混合時(shí)注意不要產(chǎn)生泡沫。CHAPS的濃度一定要準(zhǔn)確地配制成0.5% （8.132 mmol/l ）。如果濃度過(guò)高，會(huì)增加從蓋玻片上掉落的細(xì)胞，一部分的細(xì)胞骨架會(huì)溶解下來(lái)。如果濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的溶解效果差。
*3 CHAPS的溶液量，1個(gè)直徑
*4 請(qǐng)注意振搖過(guò)強(qiáng)的話，會(huì)增加細(xì)胞脫落。
IV. 用CHAPS從原生質(zhì)體分離液胞
1. 試劑
·從Atriplex gmelini的綠葉中制得的原生質(zhì)體 （1.2 mol/l山梨糖醇中分離）
·CHAPS
·GEDTA （EGTA）
·HEPES
·山梨糖醇
·Tris
2．方法
1） 取1 ml 原生質(zhì)體放入巴氏瓶中*1。
2） 加入50 ml緩沖液 （1.0 mol/l山梨糖醇、1 mmol/l GEDTA、0.5 mmol/l CHAPS、20 mmol/l HEPES-Tris、pH8.0）。120×g離心3分鐘。
3） 收集上清液中的液胞 （約1.2 ml）*2，放入巴氏瓶中。
4） 用緩沖液 （1.0 mol/l 山梨糖醇、20 mmol/l HEPES-Tris、pH8.0） 稀釋19倍。120×g離心3分鐘, 回收上清液中懸浮的液胞。
*1 用0.5 mol/l 山梨糖醇分離原生質(zhì)體時(shí)，添加10% Ficoll 400等，使原生質(zhì)體懸浮。
*2 原生質(zhì)體的上清液不濃縮的話， 使用Ficoll 400等，需要提高溶液的比重。
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